pBAD載體系統(tǒng)是用于在細(xì)菌中表達(dá)重組蛋白的可靠且可控的系統(tǒng)，該系統(tǒng)通過(guò)araBAD操縱子控制大腸桿菌L-阿拉伯糖的代謝。將目的基因置于pBAD載體中araBAD啟動(dòng)子的下游，當(dāng)L-阿拉伯糖存在時(shí)，araBAD啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)目的基因的高效表達(dá)；當(dāng)葡萄糖存在時(shí)，目的基因的表達(dá)則被抑制。該載體系統(tǒng)可精確控制目的基因的表達(dá)，特別適用于生產(chǎn)困難蛋白，如具有毒性或不溶性蛋白。

關(guān)于該載體系統(tǒng)的更多信息，請(qǐng)參考以下文獻(xiàn)。

首先，將目的基因克隆到pBAD載體上，并將攜帶該質(zhì)粒的菌株在缺乏L-阿拉伯糖的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)以降低質(zhì)粒不穩(wěn)定性。然后，通過(guò)向培養(yǎng)基中加入L-阿拉伯糖來(lái)誘導(dǎo)目的基因的表達(dá)。

我們的pBAD載體上攜帶的雙向araBAD啟動(dòng)子可同時(shí)驅(qū)動(dòng)目的基因和調(diào)節(jié)蛋白AraC的表達(dá)。在缺少L-阿拉伯糖的情況下，AraC在啟動(dòng)子區(qū)域二聚化形成環(huán)阻斷轉(zhuǎn)錄。當(dāng)添加L-阿拉伯糖時(shí)，AraC改變構(gòu)象并結(jié)合到啟動(dòng)子中的替代位點(diǎn)，從而激活轉(zhuǎn)錄。

向生長(zhǎng)培養(yǎng)基中添加葡萄糖，宿主細(xì)胞cAMP水平降低，可以進(jìn)一步抑制目的基因的本底表達(dá)。在無(wú)葡萄糖的培養(yǎng)基中，cAMP水平很高，cAMP-CRP（代謝物激活蛋白）復(fù)合物會(huì)與pBAD啟動(dòng)子結(jié)合，從而抑制目的基因的表達(dá)，這將有利于表達(dá)具有細(xì)胞毒性或抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的目的基因的表達(dá)。

所有定制的pBAD載體都會(huì)克隆在能夠保持質(zhì)粒穩(wěn)定的大腸桿菌中（如Stbl3），可將質(zhì)粒轉(zhuǎn)移至缺乏L-阿拉伯糖分解代謝基因的宿主菌株（如TOP10）中，使目的基因有效且穩(wěn)定的表達(dá)，因?yàn)長(zhǎng)-阿拉伯糖的濃度不會(huì)隨著時(shí)間的推移降低。對(duì)于需要利用葡萄糖嚴(yán)格抑制本底表達(dá)的，則應(yīng)該使用LMG194宿主菌株。該菌株能夠在基礎(chǔ)培養(yǎng)基（RM培養(yǎng)基）上生長(zhǎng)，可通過(guò)葡萄糖進(jìn)一步抑制araBAD啟動(dòng)子。

表達(dá)高度嚴(yán)謹(jǐn)：pBAD載體系統(tǒng)比pET載體系統(tǒng)的表達(dá)更嚴(yán)謹(jǐn)。在缺少L-阿拉伯糖的情況下，目的基因可能只有非常低的本底表達(dá)，但可通過(guò)葡萄糖進(jìn)一步抑制。

誘導(dǎo)強(qiáng)度高：araBAD操縱子系統(tǒng)是高度可誘導(dǎo)的。在去除葡萄糖并添加L-阿拉伯糖后，可實(shí)現(xiàn)>1000倍的誘導(dǎo)效率。

誘導(dǎo)成本低：L-阿拉伯糖價(jià)格低廉，大規(guī)模蛋白表達(dá)經(jīng)濟(jì)實(shí)惠。

宿主要求：與pET載體不同，pBAD載體可以穩(wěn)定存在于表達(dá)菌株中，如TOP10。

表達(dá)水平次于pET載體：基于pBAD載體系統(tǒng)的重組蛋白水平低于pET載體系統(tǒng)。

誘導(dǎo)物代謝：野生型大腸桿菌可分解L-阿拉伯糖。當(dāng)表達(dá)目的蛋白時(shí)，應(yīng)該使用L-阿拉伯糖分解代謝突變的宿主菌株（如TOP10或LMG194），以避免由于培養(yǎng)基中L-阿拉伯糖的降解而引起表達(dá)不穩(wěn)定。

araBAD promoter: Drives transcription of the gene of interest when L-arabinose is present and glucose is absent. This promoter also controls AraC expression.

RBS: The ribosome-binding site and translation initiation element from T7 bacteriophage. This allows for efficient production of the protein of interest.

ORF: The open reading frame of your gene of interest is placed here.

rrnB terminator: Signal sequence to terminate the transcript made from the gene of interest, preventing run-on transcription.

Ampicillin: Ampicillin resistance gene. It allows the plasmid to be maintained by ampicillin selection in E. coli.

pBR322 ori: pBR322 origin of replication. Plasmids carrying this origin exist in medium copy numbers in E. coli.

araC: Encodes the regulatory protein of the E. coli araBAD operon. AraC inhibits expression from the araBAD promoter in the absence of L-arabinose or the presence of glucose, and activates transcription in the presence of L-arabinose and the absence of glucose.